Caracterización del citoesqueleto de actina en las neuronas olfatorias derivadas de pacientes con esquizofrenia y trastorno bipolar como un biomarcador de diagnóstico.


Clave de Proyecto: IC18087.0
Responsable del Proyecto:  Dra. Gloria Benítez King
Correo electrónico: bekin@imp.edu.mx
Colaboradores: Dr. Jorge Gonzalez Olvera, Dr. Escamilla, Dra. Marcela Valdés Tovar, Dr. Héctor Solís Chagoyán.
Fecha de inicio: dd/mm/aaaa

Fase  
Inicial.

Objetivos
Caracterizar los rearreglos de los microfilamentos y las cavidades desprovistas de microtúbulos (macroaperturas) en los precursores neuronales obtenidos de pacientes con EZ y TB y sujetos control (SC). Revertir la formación de las macroaperturas con agentes químicos estimuladores de la actividad de la ROCK y de la MLCK.

Particulares:

1. Obtener los exfoliados de la cavidad nasal de los participantes.

2. Propagar los cultivos primarios hasta pasaje 5.

3. Almacenar las células de cada uno de los pasajes obtenidos en crio-preservación.

4. Verificar la identidad de los precursores neuronales mediante la detección de marcadores específicos (tubulina beta III, nestina y OMP (por sus siglas en inglés Olfactory Marker Protein) por inmunofluorescencia.

5. Observar la formación de las cavidades o macroaperturas por microscopía en tiempo real.

6. Estudiar la organización del citoesqueleto de actina.

7. Determinar la relación entre actina globular y la actina ensamblada en los microfilamentos por detección fluorométrica.

8. Determinar los niveles de expresión de las proteínas Rho, ROCK, MLCK, CaM, miosina y actina.

9. Determinar los niveles de expresión de los ARNs mensajeros de RHO, ROCK, MLCK, CaM, miosina y actina.

10. Determinar la actividad de la MLCK y de ROCK en sistemas de reconstitución in vitro, utilizando extractos celulares obtenidos de los precursores neuronales.

11. Determinar los niveles relativos y el número de isoformas de fosfo-miosina y fosfo-actina.

12. Determinación de la tasa de migración de los precursores neuronales.

13. Determinar la concentración basal de Ca2+ intracelular en los precursores neuronales.

14. Realizar experimentos de rescate o de inducción de macroaperturas en los cultivos derivados de los pacientes y de los sujetos control, respectivamente

Metodología
Se trata de un estudio comparativo transversal donde la selección de pacientes estará a cargo de las clínicas de EZ y de TB de la Dirección de Servicios Clínicos. Los psiquiatras investigadores de dichas clínicas identificarán a los posibles candidatos a participar en el proyecto de acuerdo con los siguientes criterios: Criterios de inclusión: Reunir los criterios diagnósticos de EZ y de TB de acuerdo a lo establecido en el DSM-5 (2013). Aceptar voluntariamente participar en el estudio, firmar la carta de consentimiento informado, encontrarse en una fase de estabilización clínica suficiente para poder ser sujetos de la toma de la muestra del NEO, ambos sexos, edad entre 18 y 65 años.
Criterios de exclusión: Presentar conductas agudas de su padecimiento, lo suficientemente severas como para impedir la toma de la muestra, presentar infección de vías aéreas superiores al momento de la toma de muestra, presencia de un cuadro de rinitis alérgica, tratamiento actual con anticoagulantes.
Grupo comparativo control:
Criterios de Inclusión: Ambos sexos, edad comprendida entre los 18 y 65 años, sin antecedentes familiares de psicopatología de acuerdo a lo consignado en entrevista clínica, sin antecedentes personales de psicopatología de acuerdo a la información obtenida por la aplicación del instrumento “La lista de 90 Síntomas (SCL 90)”, aceptar voluntariamente participar en el estudio una vez que se le haya explicado el motivo y el procedimiento y que firmen la carta de consentimiento específicamente establecida para este estudio.
Criterios de exclusión: Presencia al momento de la selección de un cuadro clínico infeccioso de vías aéreas superiores, antecedentes de rinitis alérgica, tratamiento actual con anticoagulantes.
A todos los candidatos se les explicará el objetivo y el procedimiento del estudio. Si aceptan participar se les proporcionará un formato de consentimiento informado. Una vez que lo hayan leído junto con sus familiares se procederá a su firma, proporcionando al participante una copia del mismo formato.
Los precursores neuronales se obtendrán cepillando el área turbinada media inferior de la cavidad nasal como está descrito (Benítez-King et al., 2011). Posteriormente, las células se disgregarán mecánicamente y se cultivarán en medio DMEM-F12 con 10% de suero fetal bovino y antibiótico en cajas de cultivo celular hasta pasaje 5 y se almacenarán en crio-preservación. La caracterización de los precursores neuronales con marcadores específicos se realizará de acuerdo a lo descrito previamente (Benítez-King et al., 2011).
Para estudiar la formación de las macroaperturas y determinar si en este proceso interviene la fusión de múltiples vesículas secretoras con la membrana plasmática, se incubarán los precursores neuronales obtenidos de los participantes con el colorante lipófilo FM1-43, añadido en el medio de cultivo, durante 24, 48 o 72 horas. Transcurridos estos tiempos, el colorante se lavará del medio extracelular mediante perfusión durante 10 minutos o el tiempo que sea necesario para retirar el colorante de la capa externa de la membrana plasmática (Trueta et al., 2003). Los precursores neuronales se observarán por microscopía de fluorescencia en tiempo real (excitación a 488 nm; emisión a 535 nm). Las imágenes se capturarán mediante una cámara CCD y se almacenarán en una computadora personal. En caso de que las macroaperturas estén marcadas con el FM1-43, se adquirirán también series en Z para realizar reconstrucciones tridimensionales. También se estudiará el curso temporal de la formación de las macroaperturas incubando las células con FM1-43 y tomando imágenes de fluorescencia cada hora durante 24 horas o más. Las imágenes de las células se adquirirán y se analizarán con el software Image-Pro® plus de Media Cybernetics.
La organización de los microfilamentos se estudiará como se describió previamente (Bellon et al., 2007). La cantidad de actina polimerizada se determinará con un método fluorométrico utilizando faloidina rodaminada para marcar a la actina que forma a los microfilamentos (F) y la de actina globular (G) con un anticuerpo específico fluoresceinado (Alley et al, 2010). La expresión de las proteínas del citoesqueleto (actina, fosfo-actina, miosina y fosfo-miosina), así como de CaM, Rho, ROCK y MLCK en las células precursoras derivadas de los participantes se realizará mediante la técnica de Western blot. Para este propósito las proteínas de los lisados obtenidos de los precursores neuronales de los participantes se separarán por electroforesis en geles de poliacrilamida y se transferirán a membranas como está descrito (Domínguez-Alonso et al., 2015). Éstas se incubarán con anticuerpos específicos y las bandas de proteína se detectarán con la técnica de quimioluminiscencia. Se detectará como control de carga a la 3-fostato-gliceraldehído-deshidrogenasa (GAPDH). La cantidad relativa de proteína se determinará con el sistema ChemiDoc® MP imaging system de Bio-Rad®. La expresión de los ácidos ribonucleicos mensajeros (ARNm) se determinará aislando el ARN total que se extraerá de los cultivos de precursores neuronales en pasaje 5 con el método TRIzol® (Life Technologies®). La concentración y pureza de los ARNs obtenidos se determinará por espectrofotometría con el equipo Multimode Plate reader EnSpire® (Perkin Elmer). Con el dato de concentración se normalizarán las muestras y se obtendrán los ADN complementarios mediante la reacción en cadena de la polimerasa con la enzima transcriptasa reversa (RT-PCR). Se determinará la expresión relativa del ARNm de los genes que codifican para actina (ACTB), ROCK (ROCK1), Rho (RHOA), CaM (CALM1) y MLCK (MYLK) por PCR cuantitativo (qPCR) con el termociclador tiempo real CFX96® (Bio-Rad®) con las sondas TaqMan® Gene expression assay (ThermoFisher Scientific®). Hs0106066_g1, Hs01127701_m1, Hs00357608_m1, Hs00300085_s1 y Hs00364926 _m1, respectivamente. Los resultados se normalizarán con el control endógeno de la expresión de GAPDH con la sonda Hs02786624_g1. Una vez determinadas las diferencias en la expresión génica entre grupos de pacientes y el grupo control y confirmados por la densitometría del Western blot y la inmunofluorescencia, se propondrá a la organización del citoesqueleto de actina como endofenotipo candidato para el diagnóstico de la EZ y el TB. La determinación de la actividad de la MLCK y de ROCK se realizará en un sistema reconstituido in vitro. Los extractos celulares obtenidos de los precursores neuronales de los participantes se utilizarán como fuente de las enzimas y se añadirán los sustratos específicos y cofactores necesarios para la reacción como se describió (Katoh et al., 2001; Ramírez-Rodríguez et al., 2007; Bellon et al., 2007).
Los niveles relativos y el número de isoformas de miosina y de actina fosforiladas se determinará separando estas proteínas por electroforesis bidimensional y cuantificándolas con marcadores fluorescentes. Primero se obtendrán los extractos proteicos de los precursores neuronales derivados de los grupos participantes. La cantidad de proteína se determinará por el método de Lowry (Lowry et al., 1951). Se ajustará la concentración de los extractos y se realizará la técnica de inmunoprecipitación con perlas de proteína A acopladas a anticuerpos específicos dirigidos contra miosina y actina respectivamente. Las perlas se incubarán con una solución de marcaje con colorantes diferentes para cada grupo de participantes (Cy3 para el grupo de esquizofrenia o trastorno bipolar; Cy5 para el grupo control y Cy2 como estándar interno). Se realizará el isoelectroenfoque en tiras inmovilizadas de gradiente de pH y posteriormente la electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. Las imágenes de estos geles se adquirirán con el equipo ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad ®). La fosforilación se detectará utilizando los sistemas de marcaje Pro-QH Diamond phospho protein gel stain (Thermofisher®) para teñir proteínas fosforiladas y el sistema SYPRO® Ruby protein gel stain (Thermofisher®) para teñir proteínas totales. La fluorescencia resultante se analizará con el software MATLAB® (MathWorks®). Se calculará la proporción de la intensidad de señal del colorante Diamond dye entre la intensidad de señal del colorante SYPRO® por cada spot. Este dato dará información acerca del nivel de fosforilación del spot entre la cantidad de proteínas totales. Se crearán bancos de imágenes por cada grupo experimental y los análisis de fosforilación se realizarán independientemente al comparar cada grupo contra el grupo control por separado (Corena-McLeod et al., 2013; Deng et al., 2012).
Para realizar el experimento de migración, las células se teñirán in vivo con un colorante lipofílico fluorescente de la familia de las carbocianinas (Dil) que emite a 580 nm. Una vez teñidas las células, se observarán en el microscopio de epi-fluorescencia en tiempo real (Honig y Hume, 1986). La medición de la concentración intracelular de calcio se realizará con microscopía de fluorescencia y el indicador fluorescente fura-2 acetoximetil ester (fura-2 AM) (Grynkiewicz et al. 1985). Las células precursoras se sembrarán en cubreobjetos redondos y se cultivarán durante tres días con medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 1% de glutamina y 1% de antibióticos, manteniéndolas en una incubadora con control de temperatura y CO2. Al cuarto día, las células se incubarán con fura-2 AM 10 μM durante 1 h en la incubadora. Posteriormente, los cubreobjetos se colocarán en una cámara para perfundir las células con una solución de Ringer (en mM): 110 NaCl, 2.5 KCl, 1.6 MgCl2, 1 CaCl2, 5 HEPES, pH ajustado a 7.4, con una velocidad de flujo de 2mL/min. Las imágenes se obtendrán con un microscopio invertido de epifluorescencia Nikon y una cámara digital monocromática. Las imágenes serán capturadas y analizadas con el software NIS Elements® (Nikon), con los módulos especializados correspondientes. Para obtener las imágenes de fluorescencia se utilizará una longitud de onda de excitación de 340 y 380 nm y una longitud de onda de emisión de 510 nm, con una frecuencia de captura de 0.5 o 1 Hz para calcular el cociente F340/F380. La concentración de calcio se estimará con una curva de calibración para lo cual se utilizará el kit de calibración de Molecular Probes® (Catálogo F6774). La concentración intracelular de calcio se medirá inicialmente en las células precursoras obtenidas de sujetos sanos, de pacientes con esquizofrenia o de pacientes con trastorno bipolar con el objetivo de determinar si existen diferencias en la concentración basal de este catión entre los tres grupos. En el caso de detectar modificaciones en el calcio basal en las células de los pacientes respecto de las células de los sujetos sanos, se realizarán experimentos en los que se modifique la concentración basal de calcio en las células de los pacientes para asociar este cambio con una posible desaparición de las macroaperturas, o en las células de sujetos sanos para asociar la posible aparición de macroaperturas con los cambios experimentales en el nivel basal de calcio.
Los experimentos de rescate o de inducción de macroaperturas en los cultivos derivados de los pacientes y de los sujetos control se realizarán utilizando estimuladores de la ROCK como la melatonina o el inhibidor Y-27632 (Ortíz-López et al., 2009) y los inhibidores de la MLCK ML-9 y ML-7 o sus activadores como la TNFα (Xiong et al 2017). Las células se incubarán con estos compuestos y se observará la formación de macroaperturas como se describió al inicio de la sección de métodos.

Resultados esperados